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分子熒光光譜法測定維生素B2的含量
来源:/   作者:紫外可見分光光度計    更新日期:2016-09-30 11:14:26   
摘要:分子熒光光譜法測定維生素B2的含量。

分子熒光光譜法測定維生素B2的含量

A. 实验原理
常溫下,處于基態的分子吸收一定的紫外—可見光的輻射能成爲激發態分子,激發態分子通過無輻射躍遷至第一激發態的最低振動能級,再以輻射躍遷的形式回到基態,發出比吸收光波長長的光而産生熒光。固定一個假設的發射波長進行激發波長掃描,找出最大激發波長λex,然後固定最大激發光波長λex進行熒光發射波長掃描,找出最大發射波長λem。最大激發波長和最大發射波長的選擇是本實驗的關鍵。
在稀溶液中,熒光強度與物質的濃度呈線性關系。由于熒光物質具有猝滅效應,此方法僅適用于痕量物質分析。
维生素B2也称核黄素,是橘黄色无臭的针状结晶。易溶于水,而不溶于乙醚等有机剂。光照易分解,对热稳定,在中性或酸性溶液中稳定,在碱性溶液中较易被破坏。维生素B2水溶液在430~440 nm蓝光或紫外光照射下会发出绿色荧光,荧光峰在525 nm附近,在pH为6-7的溶液中荧光强度最大。最大激发波长λex=465 nm,最大发射波长λem=520 nm。pH=11时,荧光消失。维生素B2在水溶液中稳定。在稀溶液中,其荧光度与维生素B2溶液浓度呈线性关系。
維生素B2在堿性溶液中經光線照射會發生分解而轉化爲另一物質光黃素,光黃素也能發出熒光,其熒光強度比維生素B2強,所以測量維牛素B2的熒光時要控制在酸性和避光條件下進行。
B. 仪器、试剂
1.儀器
RF-530IPC熒光分光光度計;電子天平
移液管(2 mL);棕色容量瓶(50 mL、1000 mL)。
2.試劑
維生素B2;冰醋酸(分析純);多維葡萄糖粉(含有維生素Bi、維生素B2、維生素C、維生素D和葡萄糖)。
3.標准溶液的配制
维生素B2标准储备液(10μg·mL^-1):准确称取10.0 mg维生素B2,用热去离子水溶解后,转入1000 mL棕色容量瓶中,冷却后加去离子水至刻度,摇匀,置于暗处冰箱内保存。
C. 实验步骤(略)
D. 注意事项
(1)吸量管、容量瓶的正確使用及移液、守容須規範操作,配制標准溶液時,爲了減少誤差,取不同體積的同種溶液應用同一移液管。
(2)使用熒光分光光度計時,須按照既定程序進行。在測定系列濃度標准溶液的熒光強度時,必須按濃度由低到高的順序放入測定。
(3)因爲熒光是從石英池下部通過,所以拿取石英池時,應用手指捏住池體的上部,不能接觸下部。清洗樣品池後,應先用吸水紙吸幹四個面的液滴,再用擦鏡紙往同一方向輕輕擦拭。
(4)在測試樣品時,府沣煮樣品的濃府不能太高,否則由于存在熒光猝滅效應,樣品濃度與熒光強度不呈線性關系,造成定量工作出現誤差。

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